Моноклональные антитела: препараты, цена, применение при псориазе

Моноклональные антитела при псориазе

Псориаз и его различные проявления в виде псориатического артрита, эритродермии – это хроническое заболевание кожных покровов, ногтей.

Лечить его крайне сложно и, в первую очередь, применяют иммуномодуляторы (а именно – иммуносупрессоры) для подавления гиперактивности иммунной системы и регрессии клинических проявлений псориаза, но бывает и так, что этого недостаточно. В случаях, когда стандартные иммуносупрессоры неэффективны, назначают медикаменты на основе моноклональных антител.

Что такое моноклональные антитела?

Моноклональные антитела – это продукт слияния В-лимфоцита и плазмоцитомы, разновидности рака крови. В-лимфоцит выступает продуцентом антител – это белковые комплексы гуморального иммунного ответа.

Эти соединения белковой природы (еще их называют иммуноглобулинами) секретируются В-лимфоцитами, а именно – плазмоцитами (активированные В-лимфоциты) в ответ на внедрение чужеродных агентов.

Каждый В-лимфоцит экспрессирует один тип специфических иммуноглобулинов, далее происходит редупликация (клонирование плазмоцитов) и быстрое увеличение количества идентичных по структуре антител, образуя популяцию клонов одного исходного В-лимфоцита.

Польза и вред моноклональных антител при псориазе

Основная концепция применения моноклональных антител в лечении псориаза заключается в высокой специфичности к определенным мишеням (антигенам) и принципиальной смене лечения от неспецифической к новой специфической (таргетной) терапии.

Таргетная терапия – это воздействие лекарственных средств на псориаз на клеточном и молекулярном уровнях, вплоть до блокировки рецепторов на клетке к тем или иным веществам.

Моноклональные антитела при псориазе — лечение

Основная мишень в лечении псориаза – фактор некроза опухоли (ФНО). Это белок, который продуцируют клетки иммунной системы и вызывают усиленный иммунный ответ.

Медикаментозные средства на основе моноклональных антител целенаправленно блокируют только ФНО и обладают свойством снижать воспалительные реакции организма вплоть до ремиссии заболевания. В этом плане подобные препараты не имеют аналогов в лечении и являются самыми эффективными.

Противопоказания и побочные действия

В некоторых случаях и на моноклональные антитела в составе лекарственных средств у больных может развиваться иммунный ответ. Поэтому целесообразной будет обязательная консультация у врача и применение медикаментозных средств при псориазе на основе моноклональных антител совместно с иммуномодуляторами.

Таргетная терапия имеет сравнительно низкий процент побочных эффектов, так как оказывает местное, локализованное действие на конкретные клеточные структуры, а не на всю иммунную систему, как это делают иммуномодуляторы, вызывая общее угнетение всех направлений защиты организма.

Противопоказания выражены в индивидуальной непереносимости, беременности, острых инфекционных заболеваниях.

Насколько безопасны моноклональные антитела?

Прием моноклональных антител при псориазе следует проводить в стационаре под строгим наблюдением врача, эти препараты вводятся внутривенно при помощи капельницы, так как выпускаются преимущественно в виде растворов, а не в таблетках.

Безопасность этих препаратов можно выразить в таком сравнении – доля одобренных к применению разработок препаратов на основе моноклональных антител на порядок выше, чем у других типов лекарств.

Препараты на основе моноклональных антител

Моноклональный препарат при псориазе цена их довольно высокая в силу специфики производства.

Все препараты на основе моноклональных антител работают по одному принципу – связывают растворимую и трансмембранную формы ФНО, а также вызывает лизис клеток, которые эксперссируют ФНО.

Медикаментозные средства на основе моноклональных антител имеют свою номенклатуру, все они оканчиваются на –mab (от Monoclonal antibody) и включают подоснову -кси – химерное антитело, -у – человеческое антитело:

• Симпони, (голимулаб).
• Раптива (эфализумаб).
• Ремикейд (инфликсимаб).

Также для лечения псориаза используют препарат на основе моноклональных антител Амевив (алефацепт), который создан одним методом «белков слияния», где искусственно соединяются два белка с различным функционалом.

Где купить — цена

Используя моноклональные антитела при псориазе следует помнить о цене, которая зачастую и является точкой «преткновения».

Купить их смогут не все из-за высокой стоимости. Все препараты имеют такую тенденцию, чем новее препарат, тем он дороже.

Цены лечебного курса стартуют от 50 000 рублей. Ремикейд в продаже с 1998 года и имеет наиболее низкую цену от 28 до 51 тыс. рублей за 100 г препарата, Раптива и Симпони немного дороже примерно 60 – 70 тысяч, цена Амевив на порядки выше.

Материалы, размещенные на данной странице, носят информационный характер и предназначены для образовательных целей. Посетители сайта не должны использовать их в качестве медицинских рекомендаций. Определение диагноза и выбор методики лечения остается исключительной прерогативой вашего лечащего врача! Компания не несёт ответственности за возможные негативные последствия, возникшие в результате использования информации, размещенной на сайте Fitohome.ru

https://www.youtube.com/watch?v=6HiMYO-TWBY

Моноклональные антитела: препараты, цена, применение при псориазе

Преимущества и недостатки

Моноклональные антитела при псориазе блокируют работу цитокинов – небольших пептидных молекул, которые действуют следующим образом:

• активируют Т-клетки;
• передают сигналы воспаления и пролиферации;
• регулируют межклеточные взаимодействия.

Подтвержденные данные последних исследований доказывают, что эти рекомбинантные вещества успешно воздействуют на основные нарушения при псориазе. К тому же за короткий промежуток времени удается добиться полной очистки кожи, благодаря нейтрализации фактора некроза опухоли (ФНО). Эту линейку препаратов чаще применяют для лечения тяжелых, суставных форм болезни, в особенности, если они устойчивы к другим способам лечения.

Основное преимущество использования – они не подавляют весь иммунитет, а действуют локально, тем самым позволяя выполнять иммунитету свою главную функцию – защищать организм от чужеродных агентов.

К недостаткам лечения моноклональными антителами обычно относят:

1. Большой список побочных эффектов.
2. Необходимость в постоянном медицинском контроле за состоянием пациента.
3. Повышенный риск инфекционных и онкологических заболеваний.
4. Высокая стоимость лечения.

Хотя эффективность терапии этими препаратами доказана, лечение все равно не может основываться только на введении медикаментов – требуется комплексный подход. Немаловажную роль при этом играет строгое соблюдение диеты и обязательное проведение ежедневных гигиенических процедур. А методы терапии устанавливаются лечащим врачом для каждого пациента индивидуально, учитываются доминирующие нарушения и ранее проводимая терапия.

Как получить такие антитела?

Очевидно, что путем иммунизации, то есть введением животному индивидуального антигена или только одной его детерминантной группы, это сделать, как правило, невозможно. Почему? Дело в том, что в организме в процессе созревания антителообразующих клеток (АОК) образуется большое количество (миллионы) генетически однородных семейств клеток — клонов, каждый из которых специализируется на синтезе только одного варианта антител, и в этом причина большого разнообразия антител, индуцируемых даже одним антигеном.

Казалось бы, выход прост: надо вырастить отдельные клоны антителообразующих клеток in vitro — в культуре тканей — и они будут продуцировать моноклональные антитела, то есть антитела одной строго определенной специфичности, продукт одного клона. Но и это оказалось невозможным: нормальные клетки смертны, вскоре после высаживания в культуру они погибают. Дело не доходит до образования клонов АОК. Добавление в культуру факторов роста несколько продлевает их жизнь, но тоже не решает проблемы.

Синтетические моноклональные антитела

Следующий этап после получения гибридом — клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в специальные пластиковые планшеты, содержащие обычно 96 лунок емкостью примерно по 0,2 см3. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток, которые культивировали в присутствии «кормящих» клеток, не имеющих отношения к гибридомам, но способствующих их росту.

После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Для этого использовали микрометоды выявления антител к соответствующему антигену. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали (то есть повторно рассевали по таким же лункам, но из расчета 1 клетка на лунку), вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител.

Процедуру повторяли 1–2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела [2]. Полученные клоны можно заморозить при −70 °С и хранить до того, пока они не потребуются. Их можно культивировать и накапливать антитела в культуральной среде, а можно привить мышам (так как гибридомы — это опухолевые клетки), где они будут расти и накапливать колоссальные количества моноклональных антител.

Автор дополнительной главы — Жанна Олиферова.

В 1975 году, когда Кёлер и Мильштейн опубликовали статью о методе получения гибридом [4] и предположили, что этот метод может быть использован в медицине и промышленности, мало кто верил в возможность практического применения моноклональных антител. Как ни курьёзно это сейчас звучит, в ответе, полученном Мильштейном из национальной корпорации по исследованиям и разработкам в 1976 году, была фраза:

«Нам, несомненно, трудно сейчас определить непосредственные практические применения [метода гибридом], которые имели бы коммерческий потенциал…» [5]. В наши дни моноклональные антитела стали одним из необходимых реагентов в биологической лаборатории, а объёмы продаж лекарств, созданных на их основе, превышают миллиарды долларов [6].

Развитие каких технологий сделало возможным такое широкое их применение? Этот раздел статьи посвящен истории создания популярного современного метода получения моноклональных антител, который пришёл на смену технологии гибридом, и виртуозному применению синтетических моноклональных антител для решения научных проблем.

Описанный выше метод гибридом позволил получать неограниченное количество моноклональных антител, специфичных к одной детерминантной группе. Их широкое применение в медицине и иммунологии поставило новые задачи:

1. Мышиные антитела плохо подходят для использования в клинической практике — они вызывают иммунный ответ в организме человека точно так же, как введённый антиген приводит к выработке антител у мышей, из-за чего они быстро удаляются из организма. Стремление создать полностью человеческие антитела для клинической практики стало стимулом для разработки новых технологий.
2. Иммунизация — необходимое условие для получения гибридомы, но не все молекулы могут легко активировать АОК. Например, они могут быть слишком токсичны для введения мышам. Каждая гибридома производит антитело только к одной детерминанте, но не всегда можно выбрать антитела с необходимой специфичностью к нужному белку даже из большого количества гибридом. Например, у исследователя могут быть такие требования к антителам: специфически связываться только с одним из двух похожих белков или узнавать только одну конформацию белка. Получить такие антитела при помощи метода гибридом очень трудно, потому что при иммунизации антитела могут вырабатываться к антигенным детерминантам, которые одинаковы у двух белков, так как они расположены на поверхности и более доступны для связывания антител. Требовался новый метод, который бы позволил получать антитела нужной аффинности и специфичности, не прибегая к иммунизации мышей.

Появление такого метода стало возможном благодаря развитию нескольких научных направлений. Прежде всего этому способствовал прогресс в понимании структуры и функции антител. Какой механизм обусловливает высокую аффинность и специфичность антител, которые производит гибридома? Во время дифференцирования B-лимфоцитов (в процессе соматической генетической рекомбинации) нуклеотидная последовательность гена, кодирующего вариабельный домен B-клеточного рецептора, собирается из нескольких сегментов (рис. 4).

Эта последовательность уникальна у каждой B-клетки, как и рецепторы на её поверхности. Когда B-клетка узнаёт свой антиген, она активируется и становится АОК, часть из которых сразу начинает производить антитела низкой аффинности. Рецепторы других АОК проходят процесс аффинного созревания, в результате которого аффинность и специфичность рецептора АОК, а, следовательно, и антител, повышается.

Аффинное созревание основано на соматической гипермутации, в процессе которой в последовательности вариабельных доменов рецепторов специальные белки вносят 1–5 мутаций на каждое деление клетки. Большинство мутаций приводит к тому, что B-клетка перестает узнавать антиген и погибает. Редкие мутации повышают аффинность рецептора к антигену (такие мутации накапливаются в CDR-участках), и B-клетки, несущие такие рецепторы, выживают, размножаются и производят антитела с высокой аффинностью и специфичностью [7], [8].

Развитие методов генной инженерии привело к появлению новых возможностей: вариабельные и константные участки генов, кодирующих антитела, можно комбинировать в пробирке, вносить в них мутации, отбирать необходимые варианты и экспрессировать в бактериях. Так можно получать антитела с нужными свойствами, не иммунизируя мышей.

Для того чтобы это стало реальностью, сначала надо было создать библиотеки вариабельных доменов антител. Начало этому было положено в 1989 году, когда соответствующие гены были выделены из пяти гибридом и из активированных клеток селезёнки иммунизированных мышей. Эти гены были клонированы, и были определены их нуклеотидные последовательности.

В 1988 году Fab-фрагмент антитела впервые был экспрессирован в бактерии. Чтобы создавать антитела без использования гибридом, оставалось решить последнюю задачу: физически связать между собой антитело и кодирующий его ген, тогда выбрав из библиотеки антитело, специфичное к данной молекуле, можно клонировать его ген для экспрессии в бактерии и получать нужное количество антител.

В 1990 году Г. Винтер и соавторы встроили в геном бактериофага нуклеотидную последовательность Fab-фрагмента антитела, объединив его с частью гена поверхностного белка III этого фага [10]. Это позволило экспрессировать на поверхности каждой вирусной частицы несколько копий этого гибридного белка, сохраняющего специфичность к своему антигену, — а значит, можно было проводить селекцию нужного антитела из фаг-дисплейной библиотеки (рис. 5).

Один раунд селекции может увеличить частоту фага, специфичного к данному антигену, в 1000 раз. За несколько раундов можно из большой популяции выделить редкие фаги, специфичные к данному антигену, извлечь из них ДНК, определить нуклеотидную последовательность и клонировать для получения антител в бактерии.

Кристаллографические структуры комплексов антиген—антитело позволили понять принципы организации, стоящие за кажущимся бесконечным разнообразием природных антител [11], [12]. Например, за исключением CDR-участков, структура антител довольно консервативна: известно всего несколько десятков различных структур, некоторые из которых более стабильны и встречаются в природных антителах чаще.

При создании современных фаг-дисплейных библиотек выбирается одна наиболее стабильная структура вариабельных доменов тяжёлой и легкой цепи, разнообразие аминокислотных остатков CDR-участков создаётся искусственно [12]. Анализ природных антиген-связывающих сайтов антител выявил, что наиболее часто непосредственно взаимодействуют с поверхностью антигена аминокислотные остатки тирозин (Tyr) и серин (Ser), поэтому первые библиотеки синтетических антител получали, варьируя именно эти остатки в ключевых позициях CDR.

Дорогу указывают опухоли

Путь решения проблемы неожиданно указали злокачественные опухоли. Уже давно известны опухоли у человека — плазмоцитомы, вырабатывающие и секретирующие в кровь иммуноглобулины, по структуре своей неотличимые от антител. Причем каждое такое «антитело» слегка отличалось от другого, вырабатываемого другой плазмоцитомой.

Почему именно опухоли указали на возможность получения моноклональных антител? Есть несколько причин, и все они коренятся в самой природе опухолевой клетки. Она всегда (или почти всегда) сохраняет свойства и функции клетки, из которой произошла. Плазмоцитома происходит из «юных» плазматических клеток, то есть как раз из тех клеток, которые синтезируют антитела.

Это свойство сохраняется в опухолях, возникших из соответствующих клеток. Очень важной особенностью опухолей является их возникновение из одной генетически измененной (мутантной) клетки. Поэтому опухоль возникает и развивается как клон, в нашем случае как клон иммуноглобулинобразующих клеток. Причем они образуют строго однородный по всем свойствам моноклональный иммуноглобулин.

Нормальные плазматические клетки (или их предшественники — лимфоциты) смертны, их срок жизни — несколько дней. Опухоль, и в этом ее принципиальное отличие от нормальных предшественников, бессмертна (См. также: «Бессмертные клетки Генриетты Лакс»). Ее можно культивировать в пробирке или пересаживать от одного животного другому неограниченное число раз и в течение неограниченного времени.

В отличие от нормальной ткани опухоль автономна; организм «хозяина» неспособен (за очень редкими исключениями) остановить неограниченный рост злокачественного опухолевого клона. Плазмоцитомы возникают не только спонтанно, то есть непредсказуемо: их можно довольно легко индуцировать у мышей и крыс и получить бессмертный, неограниченно растущий, перевиваемый клон клеток, продуцирующих иммуноглобулины, иногда обладающие специфичностью антител, причем антител моноклональных.

Вполне естественно было желание иммунологов научиться получать плазмоцитомы, продуцирующие антитела заданной специфичности. Для этого мышей вначале интенсивно иммунизировали, а затем индуцировали у них плазмоцитомы, чтобы получить опухоли и из тех клонов, которые производили антитела к антигенам, использованным для иммунизации, но это практически не удавалось.

Слишком редки были совпадения. Тогда попробовали индуцировать опухоли антителообразующих клеток опухолеродными вирусами. Результаты были лучше, однако создать простой и универсальный метод получения моноклональных антител на этом пути также не оказалось возможным.

Этанерцепт

Рекомбинантные технологии помогли создать искусственный препарат, в основе которого лежит растворимый ФНО человека. С его помощью удается не только снизить риски развития поражений периферических суставов, но и добиться приостановки прогресса структурных повреждений. Если прием препарата отменяют, то в течении 25-35 дней возможен рецидив заболевания.

Как это было сделано?

Успех пришел, как всегда, неожиданно, как побочный продукт исследования, имевшего иные цели. В начале 70-х годов молодой немецкий иммунолог Жорж Кёлер, получивший стипендию для работы в знаменитом Базельском институте иммунологии, заинтересовался вопросом о генетической изменчивости антител. В то время можно было ожидать, что антитела мутируют (генетически изменяются) с бóльшей частотой, чем другие белки.

Стелара

Активное вещество – устекинумаб. Препарат блокирует воздействие ИЛ-12 и ИЛ-23 на активацию иммунных клеток. Во время приема препарата значительно увеличивается риск развития серьезных инфекций и злокачественных новообразований.

На клинический эффект влияет концентрация Стелары в крови. Дозировка зависит от массы тела – если она до ста кг, то назначают 45 мг, если свыше, то дозу увеличивают до 90 мг.

Гибридóмы

Методы гибридизации соматических (то есть не половых) клеток к тому времени были хорошо известны и широко применялись для разных целей. Для этого использовали вирус, способствующий слиянию клеток. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали двуядерные гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям.

В процессе клеточного деления хромосомы обоих ядер перемешивались и образовывали общее ядро. Таким образом, возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридóма. Гибридому можно получить и между нормальной АОК и опухолевой, плазмоцитомной клеткой. Плазмоцитома была взята потому, что она больше всего соответствовала АОК по типу дифференцировки:

Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей среде. Прежде всего был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которого можно было контролировать составом питательной среды. Для получения мутанта использовали особенности синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), имеющихся во всех клетках и необходимых для их существования.

Известно, что имеются два пути синтеза предшественников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной — это путь новообразования нуклеотидов (звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот). Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем — способностью синтезировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот: гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего.

Для селекции гибридом надо было получить мутант плазмоцитомы, не способный пользоваться резервным путем и, следовательно, погибающий в среде, содержащей Г, A и T (ГАТ-среда). Такой мутант получили путем добавления в среду токсических аналогов Г и Т. Все клетки, способные усваивать Г и Т, включали их токсичные аналоги и погибали.

Выживали лишь те редкие мутанты, которые были неспособны усваивать Г и Т, то есть были лишены резервного пути. Из потомства этих клеток дополнительно отбирали еще и такие мутанты, которые утратили способность к синтезу собственных иммуноглобулинов. Теперь все было готово для получения гибридом, то есть гибридов нормальных АОК и плазмоцитомных клеток (рис. 1).

Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом — белком, бактериальной клеткой или клеткой животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК), и из них готовили взвесь клеток. К ней добавляли в избытке клетки мутантной плазмоцитомы и полиэтиленгликоль (ПЭГ).

После короткой инкубации, требующейся для слияния клеток, их отмывали от ПЭГа и помещали в среду, содержащую Г, Т и А (ГАТ-среда). Теперь в системе находились гибриды АОК и АОК, АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными АОК и клетки плазмоцитомы. Из них нужно было отобрать только гибриды АОК и плазмоцитомы.

Плазмоцитомные клетки и их гибриды также погибали, так как А блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а Г и Т их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь — от нормальной клетки. Такие гибриды — гибридомы — сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела.

Применение

Обычные поликлональные антитела давно и широко применяются для определения биологически активных веществ — белков крови и других биологических жидкостей, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и иммунитета, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов и т.п. Моноклональные антитела из-за высочайшей специфичности, стандартности и технологичности получения успешно вытесняют и заменяют иммунные сыворотки.

Далее гибридомы создают уникальные возможности в аналитических целях: их можно применять как «иммунологический микроскоп» с чрезвычайно высоким разрешением. Так, например, если нужно сравнить две клеточные линии, отличающиеся одним или немногими антигенами, и надо выявить такие антигены, то метод гибридом предоставляет для этого исключительные возможности.

Проиммунизировав мышей одной из линий и получив сотни гибридом, продуцирующих антитела к антигенам этой линии, можно найти одну или две с антителами только к данной линии. Размножив такую гибридому в пробирке или вырастив ее на мышах, можно получить огромное количество антител к уникальному антигену (или детерминантной группе), затерянному среди других компонентов клетки подобно иголке в стоге сена.

Это будет продукт одного клона. В крови иммунизированного животного среди множества других антител он никак не проявится из-за чисто количественных отношений. Благодаря же гибридомам его можно не только обнаружить, но и вывести в линию и получить любое количество соответствующих антител. С помощью гибридом можно обнаружить антигены, характерные для опухолей определенных тканей, получить к ним антитела и использовать их для диагностики и типирования опухолей.

Такие моноклональные антитела нашли широкое применение в онкологической клинике. Наконец, во всем мире ведутся активные исследования по использованию моноклональных антител в качестве специфических переносчиков токсических веществ в опухолевые клетки. Пока же с помощью моноклональных антител в опухоль и ее метастазы доставляются радиоактивные вещества, позволяющие обнаружить небольшие узелки опухоли по локализации в них радиоактивности.

Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии. Они созданы на основе клонально-селекционной теории иммунитета [3] и явились самым ярким и окончательным доказательством этой теории. Гибридомы сделали реальностью предполагаемые клоны антителообразующих клеток и позволили даже обнаружить их существование в организме до введения соответствующего антигена.

Гибридомы революционизировали иммунологическую промышленность и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей. И хотя гибридомы скорее относятся к гениальным изобретениям, а не к открытиям, они были отмечены в 1984 году Нобелевской премией «за открытие и разработку принципов выработки моноклональных антител с помощью гибридом».

Если бы Кёлер и Мильштейн запатентовали свой метод, они вскоре бы стали миллиардерами, так как все, кто использовал бы гибридомы в коммерческих целях, должны были бы платить за право пользоваться патентом. Авторы гибридом, несомненно, понимали это, но в интересах развития науки не пошли на такой шаг.

Метод гибридом беспрепятственно вошел во все сферы иммунологии, и сами авторы всемерно способствовали этому, предоставляя свою клеточную линию плазмоцитомы для исследований всем желающим. И первые гибридомы в нашей стране, полученные в 1979–1980 годах, были созданы на основе клеток, ведущих происхождение из лаборатории этих авторов и с их любезного разрешения.

Первоначально статья была опубликована в Соросовском образовательном журнале [1], позже — на сайте автора.

В настоящей главе рассматриваются вопросы качества при регистрации моноклональных антител, полученных из моноклональной линии клеток, предназначенных для терапевтического и профилактического (в том числе для применения ex vivo), а также для диагностического применения in vivo.

Принципы, изложенные в настоящей главе, применимы к моноклональным антителам, используемым в качестве реагентов, а также к лекарственным препаратам, разработанным на основе моноклональных антител, таким как фрагменты иммуноглобулинов, конъюгаты, гибридные белки и др. Однако использование указанных принципов определяется индивидуально для каждого конкретного препарата с учетом специфики их свойств и будет рассмотрено в отдельных документах.

Поликлональные антитела (фракционированные и рекомбинантные) в настоящей главе не рассматриваются, однако по возможности следует использовать описанные в них принципы.

Настоящая глава не распространяется на:

• моноклональные антитела, предназначенные для использования in vitro;
• моноклональные антитела, применяемые в клинических исследованиях.

Однако при производстве и контроле моноклональных антител для клинических исследований необходимо учитывать принципы, описанные в настоящей главе; их применимость будет определяться в индивидуальном порядке.

Ремикейд

Препарат с активным веществом инфликсимаб взаимодействует с ФНО-альфа, снижая его функциональную активность за счет соединения с его растворимой и трансмембранной формой.

В отличии от других, вводится внутривенно капельно. Перед применением его необходимо приготовить. Для этого сначала потребуется в воде для инъекций растворить содержимое флакона, а после – добавить NaCl. Готовый раствор вводят внутривенно со скоростью менее 2 мл/мин, дозировка рассчитывается в следующем соотношении – 5 мг на кг массы тела. Цена в аптеках – около 55000 рублей.

Синтетические моноклональные антитела

Вишва Диксит и соавторы использовали фаг-дисплейные библиотеки для получения специфичных антител к Lys48- и Lys63-связанным полимерам убиквитина [15]. После четырех раундов из библиотеки были отобраны фрагменты антител, которые не связывались с моноубиквитином и были специфичны исключительно к Lys63- или Lys48-связанным полимерам, причем с наномолярной аффинностью.

Выбранные антитела экспрессировали в бактериях и определили их аминокислотные последовательности. У антител к Lys48-связанным полимерам убиквитина вариабельность аминокислотных остатков была сконцентрирована в CDRH3, поэтому для повышения их аффинности в этот же участок внесли дополнительные мутации. Полученные после повторного отбора антитела к Lys48-связанным полимерам обладали очень высокой аффинностью (1,2 нМ).

Оптимизация антител к Lys63-связанным цепям потребовала, напротив, значительных усилий. Сначала, перед повторным отбором, мутации были внесены в CDRH1 и CDRH2, но аффинность полученных антител была на порядок ниже, чем у антител к Lys48-связанным цепям убиквитина. Для дальнейшей оптимизации была получена пространственная структура К63-связанных димеров убиквитина в комплексе с антителами, которая показала, что значительная часть паратопа составлена аминокислотными остатками CDRH2 и CDRL2, в которые и были внесены дополнительные мутации.

Отобранные антитела имели высокое сродство к Lys63-связанному полимеру (6–7 нМ) и не связывались с другими конформациями убиквитина. Кристаллическая структура нового комплекса показала, что мутированные аминокислотные остатки не контактируют с поверхностью убиквитина, а повышение специфичности объясняется улучшением электростатической совместимости между поверхностями антигена и антитела.

Полученные антитела могут быть использованы для иммунопреципитации белков, модифицированных различными полимерами убиквитина, из клеточных лизатов, или для иммуннофлуоресцентного окрашивания клеток, что позволяет получить информация о пространственной организации модифицированных белков. С их помощью исследователям удалось проследить за быстрыми изменениями модификаций адаптерных белков в сигнальном каскаде, инициированном рецептором фактора некроза опухолей (ФНО) на поверхности клетки.

Через пять минут после связывания ФНО со своим рецептором, киназа RIP1, модифицировнная К63-связанными полимерами убиквитина, связывается с рецептором. К63-полимеры убиквитина необходимы для взаимодействия с другими белками и передачи сигнала. Уже через 10 минут деубиквитиназа А20 начинает заменять К63- на К48-полимеры убиквитина, что приводит к деградации сигнального комплекса и прекращению сигнала (рис. 6).

Такая же замена Lys63- на Lys48-связанные полимеры убиквитина происходит и во время передачи сигнала от других рецепторов, таких как рецептор ИЛ-1 и некоторых Толл-рецепторов. Время передачи сигнала варьирует в зависимости от рецептора: в случае рецептора ИЛ-1 замена K63→K48 происходит только через 30–60 минут после связывания лиганда [15].

Приведённый пример показывает, что развитие современных методов производства моноклональных антител превратило их в чрезвычайно точный научный инструмент, с помощью которого будет сделано ещё немало интересных открытий.

1. Абелев Г.И. (1998). Моноклональные антитела. Соросовский образовательный журнал. 1, 1–6;
2. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т. Дж., Бехтол К.Б. Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа. М.: Медицина, 1983. — 416 с.;
3. Абелев Г.И. (2002). История клонально-селекционной теории. Природа. 11,75–80;
4. G. KÖHLER, C. MILSTEIN. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497;
5. Jasanoff S. Designs on nature: science and democracy in Europe and the United States. Princeton University Press, 2011. — 392 p.;
6. Википедия:Monoclonal antibody therapy (англ.);
7. Murphy K. Janeway’s immunobiology. Garland Science, 2011. — 888 p.;
8. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунологии. М.: Мир, 2000. — 592 с.;
9. Greg Winter, Andrew D. Griffiths, Robert E. Hawkins, Hennie R. Hoogenboom. (1994). Making Antibodies by Phage Display Technology. Annu. Rev. Immunol.. 12, 433-455;
10. John McCafferty, Andrew D. Griffiths, Greg Winter, David J. Chiswell. (1990). Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348, 552-554;
11. Альтшулер Е., Серебряная Д., Катруха А. (2010). Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности. Успехи биологической химии. 50, 203;
12. Frederic A. Fellouse, Kaori Esaki, Sara Birtalan, Demetrios Raptis, Vincenzo J. Cancasci, et. al.. (2007). High-throughput Generation of Synthetic Antibodies from Highly Functional Minimalist Phage-displayed Libraries. Journal of Molecular Biology. 373, 924-940;
13. Вездесущий убиквитин;
14. «Вездесущий убиквитин» возвращается;
15. Kim Newton, Marissa L. Matsumoto, Ingrid E. Wertz, Donald S. Kirkpatrick, Jennie R. Lill, et. al.. (2008). Ubiquitin Chain Editing Revealed by Polyubiquitin Linkage-Specific Antibodies. Cell. 134, 668-678.

Хумира

Пептидная последовательность препарата идентична lgG1 человека. Активное вещество адалимумаб при связи с ФНО оказывает на него нейтрализующее действие и блокирует взаимодействия поверхностных клеточных рецепторов и ФНО. Рекомендованная доза – 40 мг раз в 2 недели.

Нельзя совмещать с приемом Абатацепта или Анакинрой. При приеме Хумиры допускается продолжение приема следующих типов лекарств:

• глюкокортикостероиды;
• салицилаты;
• нестероидные противовоспалительные средства;
• анальгетики;
• другие базисные препараты.

Однократное применение Метотрексата понижает клиренс активного вещества на 29%, а повторное – на 44%. Если пациенты не получали Метотрексат, то иногда дополнительный эффект достигается за счет увеличения дозировки Хумиры до 40 мг в неделю.

Цена в аптеках – до 60000 рублей. Форма выпуска этих препаратов – раствор для подкожного введения, исключение составляет Ремикейд, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий.

Противопоказания

Как и другие лекарства, моноклональные вещества имеют свои противопоказания:

1. Повышенная чувствительность или непереносимость одного или нескольких составляющих препарата.
2. Инфекционные патологии, в том числе в острой фазе или с тяжелым течением.
3. Возраст до 18 лет (Хумира – до 16).
4. Вынашивание и кормление ребенка грудью.

С осторожностью стоит проводить лечение при злокачественных новообразованиях.

Всегда есть вероятность появления побочных эффектов со стороны органов или систем организма, точный список которых лучше изучить в инструкции к конкретному препарату. Это могут быть как местные реакции в виде уплотнений или припухлости, так и более серьезные, например, лейкоз, сепсис или психологические нарушения.

Моноклональные антитела в отличие от других препаратов при псориазе, таблеток, мазей или инъекций, обладают наибольшей эффективностью и обеспечивают длительную ремиссию. Существенный недостаток – высокая цена, она связана с применением высоких технологий и долгим производственным процессом. Однако специалисты не останавливаются на достигнутом и продолжают разработку технологий, поэтому есть шанс, что в ближайшем будущем получится упростить технологию производства, а значит, и существенно снизить стоимость лекарства.

1. Введение

В настоящей главе рассматриваются требования к качеству моноклональных антител.

Моноклональные антитела — это Ig, характеризующиеся определенной специфичностью, источником получения которых являются линии клеток одного клона. Их биологическая активность проявляется за счет специфичного связывания с соответствующим лигандом (обычно определяемым как антиген) и обусловливает такие эффекторные функции иммунной системы, как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC).

Моноклональные антитела могут быть получены по технологии рекомбинантной ДНК (рДНК), гибридомной технологии, иммортализацией B-лимфоцитов или с помощью других технологий (например, дисплей-технологии, генетически модифицированные животные).

В настоящей главе изложены принципы и общие требования к разработке, производству, установлению характеристик и спецификации препаратов моноклональных антител, которые применяются в качестве лекарственных препаратов для медицинского применения или использования в их производстве.

4. Основные положения

Настоящая глава неразрывно связана с другими главами настоящих Правил, а также с требованиями Фармакопеи Союза («Моноклональные антитела для клинического применения»).

Структуру моноклонального антитела необходимо обосновать с учетом механизма действия, биологической активности и стабильности препарата. Обоснование характеристики структуры моноклональных антител должно содержать по крайней мере рассмотрение пригодности иммунохимических свойств иммуноглобулинов (таких как аффинность, перекрестная реактивность, изотип, аллотип), а также важности и сохранности эффекторной функции.

Кроме того, необходимо тщательно рассмотреть риск индукции иммунного ответа у пациентов, особенно если препарат не обладает высокой гомологией с иммуноглобулином человека или при выявлении в структуре потенциально иммуногенных эпитопов, поскольку это может привести к клиническим нежелательным реакциям и (или) изменению терапевтического потенциала.

Клеточный субстрат, используемый для получения моноклональных антител, должен представлять собой стабильную, непрерывно культивируемую линию клеток одного клона, разработанную по технологии рекомбинантной ДНК и (или) другим соответствующим технологиям. Основанием для выбора клеточного субстрата является оценка возможности получения продукта желаемого качества по сравнению с возможностью использования других соответствующих подходов.

Если в качестве субстрата используются клетки, полученные по технологии рекомбинантной ДНК, и характеристика системы, используемой для производства антител, должна соответствовать принципам, указанным в главах 1, 2, 5.1 и 5.2 настоящих Правил.

Если до получения моноклональной клеточной линии в ходе разработки осуществляется одна или более специфичных процедур, например, гибридизация клеток, вирусная трансформация, генная библиотека скрининга в фаговом дисплее, использование технологий in silico, in vitro или in vivo, такие методики не требуют подробного описания.

Однако необходимо представить достаточный объем сведений об этих процедурах, позволяющий оценить подлинность и чистоту моноклональной клеточной линии, значимых для безопасности и эффективности препарата (например, аминокислотные или посттрансляционные модификации, направленные на модуляцию иммуногенности или эффекторных функций, и сведения о посторонних агентах и потенциальных контаминантах).

Для получения стабильной и непрерывно культивируемой линии клеток, которая будет использована для производства антител может потребоваться иммортализация B-лимфоцитов человека или клеток другого происхождения путем слияния или трансформации клеток. Необходимо тщательно проанализировать выбранный подход с позиций безопасности и эффективности и должным образом обосновать его.

Использование B-лимфоцитов человека в качестве родительских клеточных линий поднимает проблемы, связанные с возможной передачей инфекционных агентов, в том числе агентов вариантной болезни Крейтцфельдта-Якоба, а также других патогенных для человека микроорганизмов. Использование лимфоцитов человека, трансформированных вирусом Эпштейна-Барр (EBV), создает дополнительные трудности в связи с наличием вируса EBV, способного инфицировать человека.

Гибридома, полученная путем гибридизации B-лимфоцитов человека или клеток другого происхождения с миеломными клетками, может быть использована в качестве клеточного субстрата. Происхождение и установление характеристик родительских клеток необходимо подробно описать и документировать, включая информацию о здоровье доноров, использованных партнерах гибридизации и материалах человеческого или животного происхождения, которые соприкасались с клетками (например, питающие клетки и миеломные клетки).